授课专家介绍：
王瑶，医院免疫学研究室/生物治疗病区,38岁，副高，硕士生导师。一直从事肿瘤免疫治疗相关方面的基础和临床试验研究工作，近几年以第一作者及通讯作者发表关于细胞治疗SCI论文12篇，累计影响因子60余分，CART研究结果分别在年欧洲肿瘤大会和年ASCO会议poster展出。主持国家自然科学基金项目及”军队十二五”项目各一项；以分课题组长承担国家科学支撑计划课题，课题骨干承担国家重大专项研究项目。目前所在课题组在国际上申请的有关CART治疗肿瘤的临床试验项目共计9项，CART专利申报13项，为临床试验项目CAR细胞主要负责人。
因为血液病的CART治疗效果很好所以不做过多陈述。对于治疗实体肿瘤的治疗问题，我们刚才讲过很重要的问题就是在治疗实体肿瘤的过程中，如何来避免CART细胞杀伤表达相同抗原的正常细胞。所以我们首先在体外利用病毒载体对慢病毒载体的启动子进行切割，希望病毒载体启动子修饰的T细胞只能识别高表达肿瘤抗原的肿瘤细胞而不杀伤表达肿瘤相关抗原的正常细胞。
肿瘤跟正常组织虽然表达同一个抗原，比如EGFR，但是正常组织表达的抗原的分子量亲和力大概有三千多，可是肿瘤组织抗原的亲和力有三万多，我们希望通过截短病毒启动子这个方法只识别高表达EGFR的肿瘤细胞不去杀伤这个正常细胞，这是我们一个正式实验。我们先把这个病毒载体构建成功之后，然后在体外证实了它只别肿瘤细胞而不杀伤正常细胞。
之后我们也在体内证实了这个载体结构的可行性。这是一个患者输入了EGFR-CART细胞之后进行了肿瘤组局部穿刺，我们发现正常组织和肿瘤组织虽然都表达EGFR，但是只有肿瘤部位的EGFR阳性部位发现了CART细胞，而在正常组织EGFR阳性的部位没有发现CART细胞的存在。这也就证实了我们这个载体设计在体外和体内都相对安全。在这个基础上我们开展了针对EGFR这靶点的很多实体肿瘤的治疗临床实验研究。
这个是年就已经结束的针对非小细胞肺癌的临床试验，因为现在临床上的针对EGFR靶点的比如易瑞沙等这些药物的治疗，所以EGFR还是一个相对比较好的肿瘤相关抗原靶点的选择，所以第一个实体肿瘤的CART治疗，我们选择了EGFR阳性的非小细胞肺癌。
这11患者全是传统治疗失败的难治型的非小细胞肺癌。其中包括单抗就是靶向药治疗的失败之后的患者。接受了CART治疗后有2例获得2-5个月的部分缓解，5例是2-10的月的疾病稳定。1号患者没有接受任何预处理，只接受了CART治疗，之后获得了持续性6个月的肿瘤消退。
然后我们就开展了CART针对EGFR靶点治疗胆管癌的临床试验研究，一共有16例无法手术或者术后复发的患者入组。其中有1例获得了CR，没有PR。患者因为胆管癌进展比较迅速尤其是晚期的胆管癌，10例是疾病稳定，5例疾病进展的。这篇临床试验报告CCR已经接收。
疗效是一方面，但是它的副作用也要提及。18例患者9例都出现了粘膜损伤，有些类似于单抗药物的副作用比如皮疹，口腔溃疡等。还有4例出现肺损伤，但这4例肺损伤在使用IL-6单抗受体拮抗剂之后是可以恢复的。
而我们治疗胆管癌之后，虽然CART治疗实体肿瘤外周血的CART基因的拷贝数不会像血液肿瘤拷贝数那么高，但是我们也发现如果实体肿瘤外周血基因要是能持续保持这个拷贝数的话，那么它的治疗效果是非常好的。我们与别人的预处理方案都是一样，就是采用紫杉醇和环磷酰胺进行预处理，如果患者的淋巴细胞绝对值能低于0.5，那么就能证明在体内抗体能有相对好的一个扩增条件，那么CART治疗效果就相较好。
这个是针EGFR靶点的晚期胰腺癌治疗效果的一个研究，13例术后复发或者是无法手术的晚期胰腺癌患者入组。5例获得PR，6例SD，2例疾病进展，OR率是84%，临床效果相对比较明显，目前还在在总结中。
这个是我们针对HER2靶点的研究，第一张幻灯是体外实验和动物实验。之后进行了临床实验，有9例HER2阳性的进展胆管癌和胰腺癌患者入组。而这13例胰腺癌患者在接受CART治疗之后的副作用也同小细胞肺癌和胆管癌，如皮肤粘膜的损伤，2例患者出现了三级的肺损伤,但在使用土著单抗使用之后还是能可以恢复的。
这张图展示了一个很重要的问题就是为什么实体肿瘤治疗效果不好。因为实体肿瘤不同于血液肿瘤，比如所有的恶性白血病细胞都表达CD19。但是通过肿瘤穿刺进行免疫组化染色发现，只有50%-60%的实体肿瘤高表达EGFR，剩下的肿瘤细胞不表达EGFR,也就是说没有哪一个抗原是肿瘤细胞全部表达EGFR阳性细胞全部被清除，但是有一个重要问题出现了。但是EGFR阴性的肿瘤细胞快速增长，CART无法清除全部的肿瘤细胞，那么如何解决这个问题呢？我们在后面进行了相应的改动。
但是HER2治疗效果没有EGFR治疗效果好。有1例患者是PR，5例患者是SD，但是能看到CARTHER2T细胞在体内扩增的情况，但是只有1个患者的获得了PR。
所以就回到这个问题，如何像血液肿瘤那样治疗实体肿瘤，所以我们想是否可以从肿瘤干细胞入手将实体肿瘤连根拔起。
我们就选择了CD这个靶点，CD靶点非常有意思的。首先它不像EGFR，HER2，它在外缘血有5%左右CD阳性的细胞在人外周血循环池内存在。如果是晚期的的肝癌，胰腺癌，CD循环数会更多。另外一点，它在多种内皮源的实体肿瘤都是高表达，比如肝癌，胰腺癌，结直肠癌。只要有肝转移的肿瘤基本都表达CD。另外，它还是肿瘤干细胞的一个明显的marker，就是它是最容易转移的那种细胞的marker。
同时它还是内皮祖细胞的一个表面marker，内皮祖细胞会在体内分化成内皮细胞，然后进行内皮表达内、皮修复等。但是现在已经证实内皮细胞是肿瘤发生转移一个很重要的因素，CD又是内皮细胞的表达因素，它同时和CD34在实体肿瘤中也提示着高表达。高表达也是预后差、转移的很重要因素。因此CD这个靶点我们认为不但是指肿瘤抗原，肿瘤组织表达，而且它似乎能抑制肿瘤的转移，而且还能在循环池中存在，有点类似血液肿瘤能够监控，能够促进它体内扩增。
然后从上到下就说，首先我们设计了针对CD这段病毒载体之后，成功的感染CART体细胞，建立体系。然后体外证实对CD阳性高表达和中表达的肿瘤细胞有杀伤作用，对低表达的细胞没有杀伤力作用，就证明了它的特异性以及分泌因子的特异性。之后对肿瘤老鼠做了一个动物实验，而且这个老鼠有一个明显的CART抑瘤效果。在CART组的老鼠的肿瘤组织进行了PCR检测就会发现CART明显的CART基因高拷贝的情况就证实了体外动物实验证实他的靶向性和归巢性。
因为CD跟CD34都是在骨髓中的造血干细胞中存在。我们担心CD会对患者有一个非常严重的造血抑制。所以我们就进行了一个体外克隆实验，用脐带血分离出CD34阳性的脐带血细胞，有50%多是表达CD的。之后与CART一起培养观察各个体系红细胞白细胞这种克隆的存在，发现CART克隆实验低造血干细胞没有明显抑制作用。
正式CART临床试验，我们一共进行了三个CART细胞输注计量梯度爬坡试验。除了拷贝数以外，我们还看到肿瘤标志物在第二梯队和第三梯队的患者出现明显下降。这证实我们这两剂量都是有效的，而且在相对安全的输出范围。所有患者都进行了一个肿瘤组织手术或者穿刺来确定它是CD阳性免的疫组化确定。
虽然体外就克隆实验证实CART对造血系统没有影响，但是我们为了确定它的安全的输出范围还是采用了一个标准的三加三的剂量爬坡实验，实验中有8例肝癌晚期患者入组，其中大部分患者都是索那非尼抵抗的患者。
这是我们参加三加三实验的一个示意图，简单的说就是1到3号患者先入组最低剂量，这3个患者第一剂量如果没有问题的话，1到3号患者加4号患者直接进入第二梯队。如果有一例出现了三级DLT，就是剂量相关毒性相关毒性的情况，那么就要减低剂量，之后相同进入第三剂量，然后5-8号患者在第三剂量梯队组，最后来确定适合的细胞输入数。那么这个张图就是cohort的1、2、3。我们先看第一排cohort1，我们会发现0.05-0.1×每公斤体重CART细胞对造血完全没有影响而且没有很重的副作用，但是它也没有将CART输入体内，没有使外周血的CART降低，也就是说这个剂量还不足以抑制肿瘤细胞，第二，CART基因拷贝数没有增高，所以我们认为cohort1剂量虽然安全但是无效，所以我们就把这个剂量直接关闭，随后患者加上4号患者进入cohort2
在cohort2我们采用了0.5-1×每公斤体重，我们就会发现它在外周血确实有一个轻微的一到二度的骨髓抑制。但是很明显它在CD阳性的细胞是一个明显的下降。而且，在右边这两张图的粉色曲线显示外周血CART基因明显增高。然后我们把针对5-8号患者进行了第三梯队的研究，发现髓抑制的情况依然存在，但是一到二级骨髓抑制在可以接受的范围，它的CD体外外周血的阳性细胞明显下降，而CART基因拷贝数也是在一个非常高的环境。那么我们就把第二梯队和第三梯队这个范围确定为有效剂量。
然后我们就在这个基础上进行了一个23例患者的一期临床试验，其中14例肝癌，7例胰腺癌以及2例结直肠癌患者。14例肝癌患者有12例是索纳非尼抵抗的患者，其中12例患者肿瘤是大负荷，就是肿瘤大于5厘米，其中9例患者肿瘤大于10厘米，而且9例有静脉血栓。胰腺癌和结肠癌这9例非肝癌患者全部是多发淋巴结转移，其中有6例有肝转移的患者，都是经历了很多治疗之后的一线二线抵抗的晚期癌症患者。
这些所有的患者体外扩增CART培养都是成功的。其中慢病毒CART阳性的细胞在总数中占40%左右，而TCM的CD3阳性是几乎%，记忆T细胞大概在20%左右。
我们同样采用了跟EGFR、HER2的预处理办法。但是肝癌患者全部是单一的治疗，因为肝癌有严重的肝损伤，而且很多人转氨酶都不正常，所以没办法进行环磷酰胺和紫杉醇的预处理，但是胰腺癌跟结肠癌患者还是采用一百五十毫克每平米的紫杉醇以及三十毫克每公斤的环磷酰胺进行预处理。这是整个一个疗程图，底下这个图是我们所有患者回输的细胞数，23例患者有11例只接受了一次CART治疗，3例接受了两次，9例接受了三到四次。
最重要的毒性，因为所有的一期病人实验必须把安全性放在第一位，疗效是放在第二位。安全性就是几乎所有的患者都出现了骨髓抑制，不同的白细胞、血红蛋白、血小板和淋巴细胞大概一到二级的降低。但是非肝癌的患者就是胆管癌和结直肠癌的要相对高一点。我们觉得是可能跟预处理有关，因为预处理处本身是一个化疗加一个CTX，但是这种骨髓抑制可以在一到两周都能恢复。
另外一个比较严重的三级不良事件是大概持续三周的高胆红素血症出现在三例患者中。四号、九号、二十二号这三例患者全部是有胆管狭窄或者回输细胞之前胆管就有胆红素升高的这种背景。我们后来分析了这个原因，因为所有的其他国际上报到的临床试验没有一例出现了这个严重的毒副作用的不良事件。
所以我们分析这可能因为胆管内皮组织也表达CD。但是导管内皮本身受损或者是它本身在炎性环境中就会招募更多的CART细胞攻击这个内皮细胞加重炎性反应。炎性肿胀会造成进一步阻塞和狭窄，所以造成了一个比较严重的高胆红素血症。我们就建议如果在下一期我们开展2A的时候，胆管狭窄或者胆管存在占位性病变或者本身胆固醇升高，就是所胆管有损伤的患者，我们不就建议进行CART治疗。
这个是我们的一个基本治疗效果，新英格兰的一篇综述表示索那非尼抵抗的患者生存期就是四个月。我们14例肝癌患者有9例成功的活过了4个月，目前还有2例还在持续性反应。三个月的疾病控制率是65.2%，六个月的疾病控制率是30.4%，23例患者有3个PR，14例患者疾病稳定，还有2例疾病进展。
这是一个整的疗效图，非常遗憾，因为我们入组的患者确实都是非常晚期，尤其是肝癌，都是非常大的肝癌。最好的疗效就PR，消退了30%，没有CR的患者，但这个结果与FDA刚刚批准PD1治疗肝癌的效果对比，我们的平均PFS肝癌是七个月，非肝癌是五个月，PD1治疗索纳非尼抵抗的肝癌患者，PFS是六个月，晚期的肝癌，那么刚刚批准的PD1治疗的PFS也就五个月。所以这个治疗效果虽然没有我们想象那么好，但是起码还是带来了一个相对时间长的疾病稳定。
我们总结发现如果肝癌患者肿瘤在五公分以内，虽然患者索那非尼抵抗或者做过栓塞治疗或者做过介入治疗，但是CART还是能带来一个比较长时间的基本稳定，大概十五个月跟十三个月，其中有一患者是到现在依然基本稳定。就是说如果肝癌肿瘤负荷相对低的话，CART确实还是能获得一个相对长期的基本稳定。
然后我们观察到外周血CART基因下降之后，如果患者同意，我们就会进行第二次细胞输注。我们一共有十二例患者反复进行了细胞输入，发现这些反复的细胞输注是跟它的疗效有一个直接的关系，是一个线性方程关系，而且在第一次细胞输入能获得肿瘤缩退的SD或者PR的话，再次的CART输入是能够非常有效地使肿瘤患者获益。
我们对23例中的21例（其中2例患者拒绝经常抽血去检测），进行了外周血的检测就会发现反复细胞输注都能带来这个CART基因的拷贝，而7-21天外周血拷贝数能达到一个高峰，在输注7天之后，外周血CD阳性细胞能降到一个比较低的值。
患者细胞回输细胞之后观察他的外周血的这个细胞因子的变化，就会发现如果它的白介素6有一个明显的增高倍数扩增的话，那么提示疾病的CART细胞治疗效果非常好。
我们所有23例患者中有3例患者同意在治疗之后进行再次进行穿刺，就会发现2例肝癌12号跟14号这两个患者都是进行了三次细胞输注之后发现肿瘤之前的CD高表达阳性已经全部没有了，就是在肿瘤CD变为阴性。而大量的CD浸润，CD34也在下降，就说明我们在CART还是能够非常有效地清除CD阳性的肿瘤细胞的。
因为有一个问题，我们发现虽然23个患者中，没有CR的患者，就有3例PR的。但是有一个非常令人高兴的现象就是23例患者中有21例患者在长达一年半没有出现新发的转移病灶，包括淋巴结、其他脏器转移都没有出现。因为我们刚才知道最早我们选择CD这个靶点就是觉得它是肿瘤转移一个很重要的marker，所以我们就发现这个临床实验结果还是比较令人高兴的
我们同时还检测了外周血内皮祖细胞的数量，因为内皮祖细胞(EPC)跟CD阳性的细胞外周血中高表达就提示这个肿瘤患者容易发生转移。我们就检测了6个患者的EPC情况发现2个EPC克隆没有培养成功。但另外都检测到了在细胞输入之后一个明显的下降，在肿瘤穿刺部位，因为CD34也是肿瘤发生转移的一个很重要的指标。那么它在治疗前后就会发现这个肿瘤的微血管和CD34都有一个下降。是不是可能由于这个原因CART抑制肿瘤这个患者的转移。那么是否可以配合其他的CART进行这种双靶的治疗以清除肿瘤，而且还能控制转移。
这个患者是获得PR的一例胰腺癌的患者的的影像学。第一次细胞回输之后肿瘤就有40%的之后，她又进行了两个细胞疗程治疗，在第三次之后进行了一个放疗，但是这个放疗引起了一个跟之前完全不同的CRS，就是体内的CART基因快速的出现了一个高拷贝，而且细胞因子，包括他的体温等等都出现。其实我们知道这个实体肿瘤患者CART治疗不太容易出现细胞因子风暴，它不像白血病患者接近70%的患者都会出现细胞因子风暴，所以这个应该是个好事，但是特别遗憾，这个放疗之后出现了一个肠穿孔，就已经死亡了。
就像刚才说的，我们观察到确实有抑制肿瘤转移的功能，那么我们对1例患者，这是一个病例，之前他接受过手术治疗然后化疗之后全是PD，然后就进行了EGFR的治疗之后获得了8.5月的缓解，之后疾病又进展，进展之后我们就用CART的治疗，一周之后给了她一支PD1，结果这个患者在PD1治疗之后出现了一个很严重的副作用。但是他的CART基因和炎症也出现一个比较严重的升高，所以患者又获得了一PR。
就是刚才这例患者他在EGFR治疗之后基本上没有出现很严重的副作用，连皮疹都没有，但是在之后给了一支PD1之后就会出现很严重的副作用，就发现这个综合治疗免疫治疗有可能是一个互相促进的作用。
CART治疗实体肿瘤可能不像白血病和淋巴瘤用一个单独的CART就能解决问题，它可能需要放疗去促进抗原的释放，改变肿瘤微环境。如果PD1单抗就是免疫检查点的介入用定点的修饰再次改造的体细胞，或者把PD1敲除等等这些综合治疗可能才能使CART在肿瘤治疗中有一个非常好的治疗效果。
这就是我们整个一个团队的所有有关CART研究内容简单的介绍。也是我们在CART基础走向临床的一个展示，谢谢大家，今天的内容结束了。
CART（嵌合抗原修饰的T细胞）从基础到临床之二—液体肿瘤治疗的经验：医院口腔外科专业讨论群